Selasa, 06 Oktober 2009

Protein disulfide isomerase

Protein disulfida isomerase (PDI, E.C.5.3.4.1) yang dikode oleh gen PDII ragi adalah suatu enzim yang berfungsi mengkatalisis reaksi pembentukan dan penataan ulang (isomerisasi) ikatan disulfida dalam proses folding polipeptida suatu protein ekstraselular atau protein jalur sekresi. Selain itu juga merupakan molekul chaperon yang membantu proses pelipatan protein di dalam retikulum endoplasma, dengan cara menghambat pembentukan ikatan disulfida selama folding polipeptida sehingga pembentukannya tidak terjadi secara random. PDI mengarahkan pembentukan ikatan disulfida tersebut dapat terjadi diantara pasangan residu sistein yang tepat, sehingga menghasilkan molekul protein dengan struktur tersier yang native. PDI juga merupakan komponen dari dua enzim multimer prolil-4-hidroksilase dan protein kompleks pentransfer trigliserida mikrosom (Freedman et al.,1994).
Fungsi PDI sebagai enzim dan molekul chaperon, mendasari aplikasi PDI dalam bidang kedokteran, industri makanan, farmasi maupun industri kimia lainnya. Penggunaan PDI yang beragam menuntut penyediaannya dalam skala besar. Ragi Saccharomyces cerevisiae menghasilkan PDI kurang dari 0.05 % dari total protein sel (Mizunaga et al.,1990). Rendahnya kadar PDI ragi ini memerlukan upaya over produksi PDI sehingga ketersediaanya dapat memenuhi kebutuhan di banyak industri.
Penelitian ini dirancang untuk melakukan over produksi enzim protein disulfida isomerase (PDI) ragi Saccharomyces cerevisiae di Escherichia coli. Penelitian ini akan diawali dengan mengamplifikasi dan mengklon gen protein disulfida isomerase ragi (PDII) di Escherichia coli DH5α.
Permasalahan penelitian pada tahap awal ini adalah : apakah gen PDI ragi dapat diamplikasi dengan PCR, berapakah ukuran molekul gen PDII, apakah penyambungan gen PDII ke vektor pGemT dapat menghasilkan rekombinan pGemT-PDII, dan apakah rekombinan tersebut dapat diklon di Escherichia coli DH5α.
Penelitian tahap awal ini bertujuan untuk mengamplifikasi gen protein disulfida isomerase dengan PCR, menentukan ukuran gen hasil PCR, dan mendapatkan rekombinan pGem-T -PDII dalam klon E. coli DH5α.
Kloning gen Protein disulfida isomerase ragi di E. coli DH5α dikerjakan dengan cara mengamplifikasi gen PDI ragi menggunakan PCR. Amplikon hasil PCR selanjutnya diligasi dengan vektor kloning (plasmid pGem-T) untuk mendapatkan DNA rekombinan pGem-T-PDII. DNA rekombinan hasil konstruksi ini, kemudian digunakan untuk menstransformasi E. coli DH5α. Seleksi transforman dilakukan untuk mendapatkan klon E. coli DH5α [pGemT-PDll].
Amplifikasi gen PDII ragi dengan dua buah primer, yaitu primer forward clan primer reverse menggunakan PCR telah berhasil mendapatkan suatu fragmen DNA berukuran ± 1700 pb. Sementara itu, ligasi amplikon hasil PCR dengan vektor T (pGem T) dapat menghasilkan rekombinan pGemT-PDII di dalam Escherichia coli DH5α. Karakterisasi pemotongan rekombinan pGemT-PDII dari beberapa transforman E.coli dengan enzim restriksi NdeI dan BamHI menunjukkan bahwa gen PDIl telah berhasil terklon di E. coli DH5α.
Kesimpulan dari penelitian ini adalah bahwa fragmen DNA berukuran ± 1700 pb yang ekuivalen dengan ukuran gen PDII dapat dihasilkan dari amplifikasi gen PDII ragi menggunakan PCR. Sebuah fragmen DNA (± 4700 pb) hasil pemotongan pGem T rekombinan oleh enzim tunggal NdeI, clan BamHI, serta dua fragmen DNA (± 3000 pb) dan (± 1700 pb) hasil pemotongan oleh dua enzim NdeI dan BamHI, menunjukkan bahwa rekombinan pGemT-PDII telah terkontruksi dan berhasil terklon di E. coli DH5α. Saran penelitian ini adalah perlunya melakukan penentuan urutan nukleotida gen PDII yang telah diamplifikasi dan juga meng-over ekspresikan gen tersebut baik di E.coli maupun di ragi.

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar